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PCR仪,你真的选对了吗?

更新日期:2015-11-02      点击次数:2839

  Kary Mullis博士也许并没有想到,他发明的PCR技术能够在未来三十年保持长盛不衰。这不仅要归功于DNA聚合酶的发展,也要归功于PCR仪的不断升级。如今,反应效率提高,反应体积减少,使得PCR逐渐应用在更广泛的领域。选购PCR仪,似乎并不是一件难事。然而,对于一些关键的参数,你真的了解它们的意义吗?

  快速变温

  现在,快速PCR已成为一种潮流。反应时间从90分钟缩短到30分钟,是受欢迎的,毕竟谁也不想在预约PCR仪时排队等太久。温度循环是所有PCR的基础。仪器的变温速率将决定PCR运行的整体速度。毫无疑问,变温越快,PCR运行也越快。宣传资料往往也会首先展示zui高变温速率以暗示PCR仪运行速度更快。因此,在拿到参数表时,我们*时间会留意变温速率,也就是升降温速率。

  不过,如果大家留心看,通常会发现ramp rate前面还会有一个Max,这说明制造商公布的是zui大变温速率。zui大模块变温速率(maximum block ramp rate)表示模块变温速率的极限峰值。在PCR运行过程中,上述zui大性能只在极短的时间内可达到,那种掐着秒表来计算变温速率的方法是不可取的。因此有诚意的制造商还会公布平均模块变温速率(average block ramp rate),表示在较长的变温范围内温度变化的速率。这个参数没那么炫目,但更具参考意义,具有比较价值。

  当然,样品的变温速率可没有模块那么高。这就好比在炉子上烧水,炉子很快就达到100oC以上,但水可能只有50oC。模块的热量传递到样品还需要一定的滞后时间。因此,只根据模块温度编程而不考虑样品体积的变温速率并不能算准确。Applied Biosystems在这一点上就很周道,提供了另一种参数,平均样本变温速率(average sample ramp rate)或者zui大样品变温速率(maximum sample ramp rate)。这个参数能反应仪器根据体积来控制样品达到设置温度、遵循预设的实验方案运行的真实能力,更有效地评估PCR仪的真实性能。

  以Applied Biosystems ProFlex? PCR系统为例,96孔和全新3x32孔模块的zui大变温速率达到6.0oC/秒,而标示样品的zui大变温速率也达到4.4oC/秒(1 μl样品体积)。配合快速PCR试剂,扩增500 bp的片段,不到半小时即可完成。它采用温度控制算法将样本体积及反应管的厚度考虑在内,其实际模块温度高于设置点,从而使滞后的样本温度能够更快地达到设置点(又称为模块热过冲)。算法要才可根据不同体积使样本达到稳定的设置点温度且无过冲及相关的负面效应。

  温控准确

  对于PCR反应而言,zui重要的莫过于温度控制的准确性。由于PCR是一个几何级数扩增的过程,不论是变性、退火还是延伸都需要准确控制温度,对退火而言温控显得尤为重要。有时,退火温度相差1oC,就能带来迥然不同的结果。目前,市场上的大多数PCR仪采用Peliter元件加热,温度准确性在±0.2oC左右。

  温度控制算法的性无疑会影响温度控制的。前面提到的模块热过冲,需要非常丰富的经验,的算法才可使不同体积的样本达到稳定的设置点温度且无过冲及相关的负面效应。

  对于96孔板PCR仪来说,另一个重要的参数是温度均一性,这指的是各孔之间的温度差异。均匀扩增反应板各孔的能力至关重要,在实验设计时常常被忽略。如果孔间的温度条件不一致,那么我们自然无法通过比较两个不同位置的反应孔数据,而得到可靠的结论。大多数仪器的温度均一性在±0.3到±0.5oC之间。比如,Eppendorf的Mastercycler Pro S,在20-72oC时,均一性≤ ±0.3oC,在95oC,均一性≤ ±0.4oC。

  对于梯度PCR而言,温度准确性的要求似乎更高。梯度PCR仪zui先由Eppendorf公司在1998年研发成功推向市场(Mastercycler Gradient)。通过设置一系列的梯度退火温度进行扩增,从而一次反应就可以筛选出的退火温度,优化实验,在节约成本的同时也节约了时间。

  传统的梯度PCR仪的加热模块由分别控温的2个Peltier元件组成,对它们设置不同的温度,通过热传导可形成温度梯度。不过,由于均匀的金属加热模块两端设置的高温和低温之间的热学相互作用,无法实现真正的线性梯度。实际上,均匀的金属加热模块上的温度更多呈S形曲线而非线性梯度,列间的温度差异不一致使其难以确定优化后的真实退火温度,尤其是在优化难以处理的试验时。

  Applied Biosystems在这方面就有独到的设计,它的VeriFlex加热模块有zui多有6个独立的加热/冷却模块,由温度控制器单独控制。各个Peltier模块之间用隔热材料进行物理隔离,使得相邻的Peltier模块间的温度干扰zui小化,温度控制更加。VeriFlex技术可以在金属加热模块上模拟真正的线性温度斜率。而且梯度模式和普通模式下升降温的速率一致,确保优化的PCR反应条件在随后的日常运行中也表现出一致的结果。

  研究人员的另一个噩梦是PCR反应会蒸发。这种蒸发现象使PCR反应体系中各组分浓度升高,特别是引物浓度升高,直接导致非特异性扩增。Eppendorf Mastercycler pro 梯度PCR仪则采用vapo.protect技术,防止PCR反应体系的蒸发。vapo.protect 热盖利用一块软垫覆盖PCR耗材,各种不同形状的PCR耗材都能实现覆盖。这种技术提高了结果的重复性,是小体积扩增的理想之选。Applied Biosystems则是通过热盖的自动调节和凹形设计确保PCR管的密封,基本上市场面上常见的PCR耗材都可以使用。当然,通常厂家会建议使用Applied Biosystems自己的PCR耗材,毕竟是经过厂家多重测试的,肯定也不会错。

  灵活更换

  虽说PCR仪已逐渐设计成个人化的仪器,但真的是实验室中人手一台,显然并不太实际。实验室中通常有多个课题,每个人的应用也各不相同,因此PCR仪能满足不同的需求。96孔模块是大多数人的选择,但未来有什么样的需求,当下并不清楚。抱着开放的心态,选择一台灵活的PCR仪,也许是明智的。

  许多PCR仪都允许更换样品模块,包括96孔、双48孔和384孔等。对于有些仪器,各个模块之间是独立的,就像多台PCR仪一样,可设置不同的运行程序。比如,Applied Biosystems的ProFlex PCR系统就提供3 x 32孔独立模块,允许同时运行3组实验,每组*独立,互不干扰。这种设计提高了效率,让苦苦等待成为过去。另外,除了标准的96孔模块,它还提供双96孔和双384孔模块,满足高通量的测序需要。此外还有双槽式模块可供选择,支持QuantStudio 3D数字PCR系统使用的芯片

  Bio-Rad的C1000 Touch PCR仪也提供4个可互换的模块,包括96孔、96深孔、48孔和384孔。96深孔模块可容纳0.2或0.5 ml PCR反应管,使反应体积zui高可达125 μl。这种大的反应体积适合新一代测序或芯片的样品制备。

  美好体验

  性能要,操作可得简单,这也是PCR仪选购时一个重要的考虑因素。毕竟,实验室里用户的水平参差不齐,既有经验丰富的老手,也有刚刚入门的新手。操作直观、轻松编程,相信是每个人的愿望。

  幸运的是,如今的制造商在设计时都考虑到这一点,纷纷采用硕大的触摸屏。有些人可能还不太习惯,但大多数人享受着这种随便点点就能设置好程序的过程。之前,Veriti PCR仪作为市场上*款触摸屏PCR仪,在推出时就受到很多客户的欢迎。斯坦福大学的博士后Hugo Hilton曾表示:“触摸屏显示很直观,让用户对反应过程一目了然。"随后Bio-Rad也相继推出了C1000和T100触摸型PCR仪。随着触摸屏技术的快速发展,越来越灵敏、能快速反应的PCR仪也随之产生,比如Applied Biosystems的ProFlex和SimpliAmp,那感觉和iPad是一样一样的。

  远程访问也增强了用户体验,它让用户能够通过智能手机或平板电脑,调整操作并查看初步结果。在使用ProFlex PCR系统时,你就能通过免费的My ProFlex手机客户端,从你的办公室、会议室、家里,甚至其他任何地方进行远程连接,查看PCR实验的运行情况,或查看哪个模块可以使用。

  随着PCR的应用越来越广泛,人们也希望将PCR仪带出实验室,带到诊所和田间。一些制造商也推出了便携的PCR仪,如Ahram Biosystems。不过,在大多数情况下,仪器还是摆在拥挤的实验台上。而且,一些必要的组件是不可少的,比如加热元件、电源等。因此,高性能的PCR仪还是占有一定的体积。不过,如今连测序仪都跟U盘一般大了,还有什么是不可能的呢。

  过去三十年,PCR已经带给了我们很多的惊喜。未来,仪器性能会更高,操作会更简便,功能会更多样,只是,选择会更困难。擦亮双眼,看看你真的需要什么,再做决定吧。

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