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Nature: 在非分裂期细胞中实现基因打靶的可能

更新日期:2015-12-28      点击次数:1367

  基因打靶技术,是利用同源重组的方法,建立基因定点敲除细胞系或获得基因定点敲除动物。无论CRISPR/Cas还是TALEN,都是通过造成靶位点的双链断裂,诱导靶基因产生突变。而通过同源重组实现的DNA修复在G1期的细胞中是高度抑制的,以确保有丝分裂只发生在姐妹染色单体之间。因而只也是在DNA复制之后、在细胞周期的S阶段和G2阶段发生的。所以基因打靶技术目前只能在分裂期细胞中实现。

Nature: 在非分裂期细胞中实现基因打靶的可能

  虽然许多同源重组因子是细胞周期调控的,哪些事件对于抑制G1期细胞重组是必须和充分的还是未知的。本月17日的Nature报导多伦多大学和Mount Sinai医院的Daniel Durocher及同事发现细胞周期通过控制BRCA1基因与PALB2–BRCA2的相互作用来抑制BRCA2在人体细胞中S / G2期的功能。

  乳腺癌和卵巢癌基因的抑癌基因BRCA1,PALB2和BRCA2通过同源重组促进DNA双链断裂修复。BRCA1促进DNA末端切除产生同源性搜索和解螺旋必须的单链DNA,之后它和PALB2作用招募BRCA2和RAD51到双链断裂区进行同源重组修复。在细胞G1期,BRCA1基因在染色质双链断裂区的积累是受抑制的,对应同源重组在这一阶段的细胞周期的也是受抑制的。

  该研究发现在PALB2上BRCA1相互作用位点是由KEAP1形成的E3泛素连接酶的靶标。这个PALB2作用蛋白,是cullin-3-Rbx1复合物。PALB2与BRCA1作用的泛素化抑制作用由去泛素化酶USP11抵消,这是在细胞周期中控制的。对BRCA1–PALB2作用的恢复结合DNA末端切除的活化是足够诱导G1同源重组的,用DNA过表达, siRNA, CRISPR–Cas9基因靶向编辑和免疫共沉淀等方法研究后的结论是: 抑制G1期同源重组机制是由阻止DNA末端切除和包括抑制BRCA1–PALB2–BRCA2复合物的组装等防止补充BRCA2到 DNA损伤位点的抑制。

  BRCA1–PALB2–BRCA2复合物的组装在细胞周期控制同源重组的DNA双链断裂修复中是个关键环节。PALB2上BRCA1的结合位点由 E3泛素连接酶和去泛素化酶USP11, 这两个不同作用的酶结合调节,该位点之后在G1期被CRL4复合物竞争结合。研究证明在G1期同源重组的抑制大部分都是可逆的,包括末端切割和BRCA2结合到断裂位点。

  在细胞研究能够诱导在G1期细胞同源重组的因素,有可能会成为在非分裂期细胞中进行基因打靶的一个有用方法。人体的大多数细胞并都是在活跃的细胞周期中这就造成了同源重组的实际操作的难度。这项研究使靶向基因治疗能运用于多个不同的组织。而且此研究也可能解决基因打靶中有丝分裂后期细胞中同源重组因子表达降低的问题。

 

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