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实时荧光定量PCR系统实验步骤

更新日期:2016-03-24      点击次数:2016
 实时荧光定量PCR系统实验步骤:  
    1.设计实验方案:例如对样品、实验组和对照组的一个实验流程设计  
    2.引物和探针的设计和合成  
    3.抽提RNA,测定提取的RNA的浓度  
    4.反转录PCR  
    5.定量PCR  
    6.数据分析  
    在进行实时荧光定量PCR系统验的过程中,PCR的扩增效率是一个非常重要的影响因素,因为定量PCR原理的理论方程是基于扩增效率zui大值1,因此高的扩增效率能保证定量PCR实验的性及重复性,影响PCR扩增效率主要有以下几个方面:1,扩增子的长度;2,扩增子的GC含量;3,扩增子、引物和探针的二级结构;4,PCR反应各组分的浓度;5,RNA或者cDNA的纯度。  
    进行实时荧光定量PCR系统实验时,必须设计好引物和探针,除了能获得高的扩增效率外,对PCR扩增的特异性、消除基因组DNA的扩增及提高扩增的灵敏度都有很大的影响。下图就是使用不同的引物和探针对18SRNA进行实时荧光定量PCR系统的荧光曲线图(反应条件和模板都相同)。
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