实时荧光定量PCR系统实验步骤

    1.设计实验方案：例如对样品、实验组和对照组的一个实验流程设计  

    2.引物和探针的设计和合成  

    3.抽提RNA，测定提取的RNA的浓度  

    4.反转录PCR  

    5.定量PCR  

    6.数据分析  

    在进行实时荧光定量PCR系统验的过程中，PCR的扩增效率是一个非常重要的影响因素，因为定量PCR原理的理论方程是基于扩增效率zui大值1，因此高的扩增效率能保证定量PCR实验的性及重复性，影响PCR扩增效率主要有以下几个方面：1，扩增子的长度；2，扩增子的GC含量；3，扩增子、引物和探针的二级结构；4，PCR反应各组分的浓度；5，RNA或者cDNA的纯度。  

    进行实时荧光定量PCR系统实验时，必须设计好引物和探针，除了能获得高的扩增效率外，对PCR扩增的特异性、消除基因组DNA的扩增及提高扩增的灵敏度都有很大的影响。下图就是使用不同的引物和探针对18SRNA进行实时荧光定量PCR系统的荧光曲线图（反应条件和模板都相同）。